摘要
以苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，建立了HPLC測定動物血漿、尿、糞及心、肝、脾、肺、腎等組織勻漿中淫羊藿苷的濃度。
內(nèi)容
淫羊藿苷(Icariin,ICA)是來源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿(Epimedium)植物的主要有效成分。國內(nèi)已有報道用紫外分光光度法［1］、高效薄層掃描法［2］及用外標(biāo)法定量的高效液相色譜法3，4］測定淫羊藿制劑中淫羊藿苷的含量。有關(guān)生物樣品中淫羊藿苷濃度的測定方法國內(nèi)外均未見報道，本文選擇了苯甲酸作內(nèi)標(biāo)，建立了生物樣品中淫羊藿苷高效液相色譜法，為進(jìn)行淫羊藿苷的藥物動力學(xué)研究提供了一個靈敏、可靠的檢測手段。
1 儀器、試藥和動物
日本島津LC—6A高效液相色譜系統(tǒng)，SPD—6AV紫外檢測器；SCL—6A系統(tǒng)控制器；SIL—6A自動進(jìn)樣器；CTO—6A恒溫箱；CR—3A數(shù)據(jù)處理機(jī)。ICA對照品由沈陽藥科大學(xué)植化教研室提供，純度在99%以上；苯甲酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；淫羊藿提取液(含ICA 5mg/mL)由沈陽藥科大學(xué)藥劑教研室提供。甲醇為色譜純試劑，四氫呋喃、冰醋酸、乙酸乙酯均為分析純試劑。動物為Wistar大鼠，雌雄兼用，體重282～316g，由沈陽藥科大學(xué)動物室提供。2 色譜條件色譜柱：Zorbax ODS(10μm，4.6mm×250mm)；流動相：四氫呋喃—水—冰醋酸(20∶75∶5)；流速：1.0mL/min；紫外檢測波長：270nm；色譜柱柱溫：35℃；檢測靈敏度：0.02AUFS；紙速：2mm/min。3 生物樣品的處理3.1 血漿 取樣品0.1mL置10mL離心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振蕩3min，離心(2000r/min,5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈桑瑲堅觾?nèi)標(biāo)液100μL，振蕩溶解后進(jìn)樣20μL。3.2 糞和尿 大鼠糞便樣品室溫風(fēng)干稱重后，置乳缽內(nèi)研成細(xì)末，用生理鹽水按10%稀釋使成混懸液。取混懸液0.5mL及尿樣0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取2次，合并2次提取液，于50℃水浴用氮?dú)獯蹈桑尤爰状?.0mL，振蕩溶解后進(jìn)樣10μL。3.3 組織勻漿 將大鼠斷頭處死取心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腦、睪丸各組織；稱重，用組織勻漿器制成生理鹽水勻漿，使每1mL含各組織0.4g，取此勻漿0.2mL，按血漿樣品處理，進(jìn)樣分析。4 結(jié)果與討論4.1 色譜行為 在上述色譜條件下，ICA與內(nèi)標(biāo)、淫羊藿提取液中的其它6種成分及血漿內(nèi)源物質(zhì)得到良好分離，ICA及內(nèi)標(biāo)保留時間分別為：7.92、11.93min。
4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用甲醇精密配制成1mg/mL ICA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用甲醇稀釋成100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL內(nèi)標(biāo)貯備液，再用甲醇稀釋成40μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，置冰箱保存。用ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液及空白生物樣品配制標(biāo)準(zhǔn)系列，同各樣品預(yù)處理操作，以ICA與IS峰高比為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由于糞和尿中的代謝產(chǎn)物干擾內(nèi)標(biāo)色譜峰，因此糞和尿采用外標(biāo)法，以ICA峰高為縱坐標(biāo)，ICA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果血漿、尿、組織勻漿和糞的線性范圍分別為：1～128、2～32、2～32、4～64μg/mL。血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n=6)為：Y＝0.122X-0.0099 r＝0.9999其它生物樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的r值均大于0.99。4.3 回收率分別于空白血漿中準(zhǔn)確加入一定量的ICA標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法經(jīng)提取后進(jìn)行HPLC分析，按血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測得濃度，求出方法回收率。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)提取后，與標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣測定所得各對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰高比值相比求得血漿樣品的提取回收率，見表1。其它生物樣品的方法回收率均大于95.26%，提取回收率均大于73.57%。
表1 血漿樣品的回收率和精密度(n=5)
藥物濃度
(μg/mL)
測定濃度
(μg/mL)
方法回收率
(±SD，%)
提取回收率
(±SD，%)
精密度RSD(%)
日內(nèi) 日間
2
2.02±0.06
101.0±3.0
80.35±3.5
2.0
3.0
8
8.42±0.46
105.2±5.8
81.41±4.5
3.1
5.5
32
31.23±0.76
97.60±2.4
81.07±2.0
2.0
2.6
128
129.7±4.84
101.4±3.8
83.63±3.1
3.4
3.7
4.4 精密度 用空白血漿配制含ICA 2、8、32、128μg/mL樣品每種濃度各5管測定日內(nèi)及日間誤差，結(jié)果見表1。其它生物樣品的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于7.1%。4.5 靈敏度測定 按色譜峰信噪比(S/N)為3作為檢測下限，結(jié)果顯示ICA的最低檢測濃度為0.5μg/mL。4.6 色譜分析條件選擇 淫羊藿提取液中的主要化學(xué)成分為淫羊藿苷，還有其它黃酮類化合物存在，因此在上述色譜條件下可出現(xiàn)6～7個峰。為了獲得最佳分離效果，首先用甲醇—水為流動相進(jìn)行分離，當(dāng)比例 為55∶45時，雖然ICA與其它化學(xué)成分已分離，但其保留時間較長，峰形較寬，且柱壓較高。為此，選用對黃酮類化合物分離選擇性較好的四氫呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分離效果更佳。經(jīng)過調(diào)整不同比例，多次試驗(yàn)，最后確定四氫呋喃—水—冰醋酸最佳配比為20∶75∶5。4.7 內(nèi)標(biāo)選擇 為能用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測定ICA濃度，本文對槲皮素、蘆丁、橙皮苷、氨茶堿、阿斯匹林、非那西丁、黃體酮、苯甲酸和蘭萼甲素等13種藥物進(jìn)行了測定，考察其與ICA在血漿中的分離情況，結(jié)果用保留時間小于ICA的藥物選作內(nèi)標(biāo)時，往往被血漿中干擾峰所干擾。阿斯匹林、非那西丁均在ICA前1～1.5min出峰，卻被淫羊藿提取液中其它成分所干擾。蘭萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，沒有任何峰的干擾，因此二者均可作為內(nèi)標(biāo)，考慮到苯甲酸方便易得，故認(rèn)為選用苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)更為適宜。4.8 提取溶媒的選擇 本文考察了用乙醇、乙酸乙酸及乙醇—乙酸乙酯(1∶5)為溶媒對ICA進(jìn)行提取測定，發(fā)現(xiàn)前者提取回收率小于60%，而后者雖然提取回收率大于95%，但帶入雜質(zhì)峰較多，而且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性下降。因此實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙酯為提取溶媒，各生物樣品的提取回收率均大于73%，且方法穩(wěn)定。4.9 藥物在生物樣品的穩(wěn)定性 于空白各生物樣品中加入ICA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成15μg/mL濃度生物樣品數(shù)份，置入-20℃冰箱保存，分別于第0、5、15、30d按實(shí)驗(yàn)方法測定， RSD均小于7.1%， 說明該藥物在各生物樣品中-20℃冰箱保存下，至少可穩(wěn)定1個月。4.10 血藥濃度的測定 為了檢驗(yàn)上述方法是否能滿足ICA的藥代動力學(xué)研究，應(yīng)用本方法進(jìn)行了大鼠靜脈注射淫羊藿提取液。由大鼠頸靜脈按10mg/kg(含ICA)靜脈注射，于給藥后5、10、15、20、25、30、40、60、80、120、180min于頸靜脈各取血0.25mL，肝素抗凝，離心后取血漿0.1mL按上述方法提取和測定ICA濃度，以給藥時間為橫坐標(biāo)，血漿中ICA的對數(shù)濃度為縱坐標(biāo)繪制藥時曲線，見圖2。血藥濃度測定結(jié)果表明，本文建立的分析方法可滿足ICA藥代動力學(xué)研究的需要，具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。
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