食物中維生素B6 的測(cè)定方法
微生物法
1.原理
維生素B6在酸性介質(zhì)中對(duì)熱比較穩(wěn)定，但在堿性介質(zhì)中對(duì)熱不穩(wěn)定。測(cè)量維生素B6比較經(jīng)典的方法是"微生物法"它的優(yōu)點(diǎn)是：1.特異性高、精密度好、操作簡(jiǎn)單（不需要特殊設(shè)備，易于推廣，樣品不需要進(jìn)行一系列的提純步驟）、準(zhǔn)確度高。它的缺點(diǎn)是：耗時(shí)長(zhǎng)、必須經(jīng)常保存菌種、試劑較貴。
2.適用范圍
GB/T 17407-1998，適用于藥物、食物及飼料的檢測(cè)
3.儀器
電熱恒溫培養(yǎng)箱
電熱手提式壓力蒸汽消毒器
液體快速混合器
離心機(jī)
722光柵分光光度計(jì)
硬質(zhì)玻璃試管
4.試劑
（1） 0.22mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。
（2） 0.5mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。
（3） 10mol/L氫氧化鈉：溶200g NaOH于水中，稀釋至500ml。
（4） 0.1mol/L氫氧化鈉：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀釋至1000ml。
（5） 溴甲酚綠：0.04%溶液，稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋到250ml。
（6） 培養(yǎng)基：稱取吡哆醇Y培養(yǎng)基5.3g，溶解于100ml蒸餾水中。
（7） 100ug/ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取122mg鹽酸吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，穩(wěn)定1個(gè)月。
（8） 1ug/ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)中間液：，取1ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋至100ml。
（9） 瓊脂培養(yǎng)基：吡哆醇Y培養(yǎng)基5.3g，瓊脂1.2g，稀釋至100ml。
（10） 1.5MOL/l生理鹽水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌種的制備與保存
5.1儲(chǔ)備菌種的制備與保存：以卡爾斯伯酵母菌?SaccharomycesCarlsbergensis ATCC No.9080簡(jiǎn)稱SC?純菌種接入2個(gè)或多個(gè)瓊脂培養(yǎng)基管中，在30±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)18-20小時(shí)，取出后置于冰箱中保存，至多不超過(guò)兩星期。保存兩周以上的菌種，不能立即用作制備接種用的種子液，一定要在使用前每天移種一次，連續(xù)2~3天，方可使用，否則生長(zhǎng)不好。
5.2種子培養(yǎng)液的制備：加0.5ml 50ng/ml的VB6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于尖管中，加入5ml基本培養(yǎng)基，塞好棉塞，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)（高壓鍋）151b壓力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留數(shù)星期之久。
6.操作步驟
整個(gè)步驟要避光
（1） 樣品制備：取樣0.5~10g（VB6含量不超過(guò)10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高壓蒸汽鍋121℃下水解5個(gè)小時(shí)，取出，于水中冷卻，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調(diào)PH值至4.5，用溴甲酚綠做指示劑。（指示劑由黃-黃綠色），將三角瓶?jī)?nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100ml，濾紙過(guò)濾，保存濾液即樣液于冰箱內(nèi)備測(cè)定（保存期不超過(guò)36小時(shí)）。
（2） 接種液的制備：使用前一天，將卡爾斯伯酵母菌菌種由儲(chǔ)備菌種管移種于已消毒的種子培養(yǎng)液中，可同時(shí)接種兩管，在30±0.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)18-20小時(shí)。取出離心10分鐘（3000rpm）傾去上部液體，用已消毒的生理鹽水淋洗2次，再加10ml消毒過(guò)的生理鹽水，將離心管置于液體快速混合器上混合，使菌種成為混懸體，將此液倒入已消毒的注射器內(nèi)，立即使用。3.樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2ml稀釋至200ml成為中間液，從中間液中取5ml稀釋至100ml作為工作液，濃度為50ng/ml，3組試管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培養(yǎng)基，混勻，加棉塞。
（3） 試樣的測(cè)定：在試管中分別加入0.05，0.10，0.20ml樣液，再加入5ml吡哆醇Y培養(yǎng)基，用棉塞塞住試管，將制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣測(cè)定管放入高壓鍋（121℃，15磅/英寸2）高壓10min，冷至室溫備用。
（4） 接種和培養(yǎng)：每管接種一滴接種液，于30±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)18-22小時(shí)
（5） 測(cè)定：從恒溫箱中取出后，用722分光光度計(jì)測(cè)量，用空白管調(diào)零。550nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)管所含VB6的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制VB6標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用測(cè)定管得到的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到測(cè)定管內(nèi)所含VB6的量。
7.計(jì)算
各樣管的吡哆醇含量A為：
A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3
則樣品的吡哆醇含量為：
mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104
每個(gè)樣品各測(cè)定管的吡哆醇含量為x1，x2，x3；
取液量分別為V1，V2，V3
樣品重W（g）取液量V（ml），
定容至100ml
8.注意事項(xiàng)
（1） 所有步驟需要避光處理
（2） 培養(yǎng)時(shí)每管必須在同一溫度，培養(yǎng)時(shí)間以18-24hour為宜。
（3） 本實(shí)驗(yàn)所有用水皆采用蒸餾水。