PCR基因擴增原理及操作規(guī)程

實驗原理
多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
1. 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；
2. 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；
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3. 引物的延伸：DNA模板－引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱 Taq聚合酶。
除了典型的PCR外，人們還根據(jù)各種用途設(shè)計了各種不同的PCR。如：
RT-PCR，即在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進行的PCR。
反向PCR，常規(guī)PCR允許擴增兩引物之間的DNA區(qū)段，而反向PCR則可以對靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)未知的DNA序列進行擴增。
不對稱PCR，常規(guī)PCR使用的引物濃度相同，而不對稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍。在最初20各循環(huán)中，主要產(chǎn)物是雙鏈DNA。當(dāng)?shù)蜐舛纫锉缓谋M后，高濃度引物引導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量單鏈DNA，單鏈DNA可用于序列測定