摘要
高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。
內(nèi)容
高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。
1.對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。
（1）色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料適合于分析分子量小于2000 的化合物，分子量大于2000 的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm 以上的填料。
除另有規(guī)定外，分析柱的填充劑粒徑一般在3μm~10μm 之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm），使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當?shù)恼{(diào)整。當對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種正文規(guī)定的色譜條
件的測定結(jié)果為準。
以硅膠為載體的普通鍵合固定相的使用溫度通常不超過35℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不能超過60℃。
流動相的pH 值應(yīng)控制在2～8 之間。當pH 值大于8 時，可使載體硅膠溶解；當pH 值小于2 時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用pH 值大于8 的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH 值小于2 的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機-無機雜化填充劑等。
（2）檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。
紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與待測溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與待測溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外-可見分光光度法（附錄Ⅳ A）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動相。
（3）流動相 反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇－水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18 鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應(yīng)不低于5％，否則C18 鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應(yīng)供試品并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調(diào)整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對改變量不超過±30%且絕對改變量不超過±10%為限，如30%相對改變量的數(shù)值超過10%時，則改變量以±10%為限。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。
2.系統(tǒng)適用性試驗
色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗中更重要的參數(shù)。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液對色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當調(diào)整，應(yīng)符合要求。
（1）色譜柱的理論板數(shù)（n） 用于評價色譜柱的效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按n=16(tR/W)2 或n=5.54（tR/Wh/2）2 計算色譜柱的理論板數(shù)。
（2）分離度（R） 用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標。可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內(nèi)標物質(zhì)或其它難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當?shù)姆椒ń到猓ㄟ^測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。
無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計算公式為：
R=2（tR2-tR1）/(W1+W2) 或 R=2（tR2-tR1）/1.70(W1, h/2+W2, h/2)
式中tR2 為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；
tR1 為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；
W1、W2 及W1, h/2 、W2, h/2 分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。
當對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準。
（3）重復(fù)性 用于評價連續(xù)進樣后，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5 次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標法時，通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成3 種不同濃度的溶液，分別至少進樣2 次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。
（4）拖尾因子（T） 用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：
T=W0.05h/2d1
式中W0.05h 為5％峰高處的峰寬；
d1 為5％峰高出峰頂點至峰前沿之間的距離（如圖）。
除另有規(guī)定外，峰高法定量時T 應(yīng)在0.95～1.05 之間。
峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，可根據(jù)情況對拖尾因子作出規(guī)定。
3. 測定法
（1）內(nèi)標法
按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
校正因子（f）=(AS/cS)/(AR/cR)式中AS 為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；
AR 為對照品的峰面積或峰高；
cS 為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；
cR 為對照品的濃度。
再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：
含量（cX）=f·AX/(A′S/c′S)
式中AX 為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；
cX 為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；
A′S 為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；
c′S 為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；f 為校正因子。
20090506 凌所長刪除
（2）外標法
按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：
含量（cX）=cR(AX/AR)
式中各符號意義同上。
由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進樣器進樣為好。
（3）加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。
測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤海M樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%～25%或其峰面積能準確積分〔通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標準偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%～2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD 應(yīng)小于2%〕。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2 倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。
（4）不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身
對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2 倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。
若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計算。
（5）面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。
用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。
相關(guān)資料